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    潍坊地区犊牛鼠伤寒沙门氏菌分离鉴定生物学特性

    摘 要:2013年6月,潍坊某牛场出现多头新生犊牛急性发热、腹泻情况,并在一天内死亡3头,从内脏分离到的病原菌经生化特性和培养特性及PCR检测,确诊为鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium STM).动物试验表明,该菌有很强的致病性.药敏试验表明:该菌对大多数常规抗生素都有耐药性,对头孢类药物较为敏感.

    关键词:犊牛;鼠伤寒沙门氏菌;分离鉴定

    沙门氏菌是一种重要的可引起人畜共患病的病原菌,常侵害幼畜,使之发生败血症、胃肠炎及其它组织的炎症.对成年动物往往引起散发性沙门氏菌病,在一定条件下偶尔引起急性流行性爆发.沙门氏菌也常引起牛散发性腹泻.目前沙门氏菌病已成为仅次于大肠杆菌的犊牛肠道细菌感染,并成为引起成年奶牛腹泻的最重要的细菌性病原之一.2013年6月,潍坊某牛场出现多头新生犊牛急性发热、腹泻,并在一天内死亡3头的情况,尸体解剖没有明显病理变化,我们将死亡犊牛内脏在我院实验室诊断确诊为鼠伤寒沙门氏菌引起的犊牛感染.

    一、材料和方法

    1. 材料

    (1)病料来源:潍坊某牛场死亡新生犊牛的肝脏、脾脏、淋巴结等.

    (2)培养基及生化试剂:HE培养基,麦糠凯培养基,三糖铁(TSI)琼脂、5%绵羊血琼脂,营养肉汤,生化试剂等.

    (3)药敏纸片:上海易佰聚生物公司生产.

    (4)两对引物:一对是针对沙门氏菌的特异性引物(OMPC),一对是针对鼠伤寒沙门氏菌的特异性引物(TYPH),2000Marker、PCR反应试剂购自上海岭兰生物科技有限公司.

    (5)试验动物:小白鼠购自潍坊医学院试验动物中心.

    2.方法

    (1)细菌分离:无菌采集病料于鲜血琼脂平板上划线分离,37℃培养24h,可疑菌落接种到麦糠凯平板上,过夜培养后,挑取单个菌落,图片染色镜检,同时接种到HE琼脂和三糖铁琼脂斜面上,进行培养.

    (2)生化试验:根据参考文献8进行.

    (3)参照PCR扩增体系及扩增条件和凝胶电泳检测按照参考文献进行.

    (4)药敏试验:按药敏纸片扩散法进行操作及判定 .

    (5)动物试验:8只小白鼠平均分成两组.试验组将纯培养菌株接种于营养肉汤,37℃培养24h,麦氏比浊法测定其含菌量为1.2X1010个/ml,然后腹腔接种小白鼠,每只0.2ml,对照小白鼠接种灭菌普通肉汤每只0.2ml.然后隔离饲养,观察发病及死亡情况,对死亡的立即剖检,观察其病理变化.然后采集肝、脾脏等病料,革兰氏染色,镜检.

    二、结果

    1.细菌培养特性:HE琼脂上形成中心黑色边缘透明的蓝绿色典型菌落;在麦糠凯琼脂上,菌落呈透明、无色;在三糖铁琼脂斜面上产生H2S,斜面碱性,底部酸性.

    2.细菌的生化鉴定:鉴定结果为典型沙门氏菌.

    吲哚(蛋白胨)-卫毛醇+

    3. PCR鉴定:OMPC扩增结果为阳性,表明该菌为沙门氏菌.TYPH扩增结果也为阳性,表明改菌为鼠伤寒沙门氏菌(如图1).

    1.Marker 2000 2.OMPC扩增产物204bp 3.TYPH扩增产物401bp

    4.药敏试验:该菌对大部分药物耐药,对卡那类药物比较敏感,对头孢类药物高度敏感.

    5.小白鼠致病性试验:试验组小白鼠感染后24h内死亡.死后剖检可见肝脏出血、肿大、心、脾脏等内脏有出血点.肝、脾脏涂片后革兰氏染色,可见革兰氏阴性小杆菌.对照组小白鼠未见异常.

    三、讨论

    本试验通过生化特性和培养特性以及PCR检测,最终确定了该菌为鼠伤寒沙门氏菌.牛的沙门氏菌病主要由鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌或纽波特沙门氏菌所致.在成年牛,该病常以高热、昏迷、食欲费绝、呼吸困难开始,体力迅速衰竭.病??捎诜⒉『?4h内死亡.犊??捎诔錾?8h内表现拒食、卧地、迅速衰竭等症状,于3-5天死亡.死后尸检无特殊变化,但可从血液和内脏中分离到沙门氏菌.

    鼠伤寒沙门氏菌属沙门氏菌属B群,为革兰氏染色阴性、不形成芽胞、无荚膜的杆菌.该菌为侵袭性致病菌,经口进入机体脱过胃酸作用后,在肠道内增殖,并粘附于肠粘膜上皮细胞,引起刷状缘变性,进而侵入固有层,释放毒素,导致其充血、水肿、点状出血等急性炎症反应.细菌还可以进入血循环,形成菌血症、败血症、引起急性全身性感染.

    我们进一步对该菌做的动物试验证明,该菌有很强的致病性.从药敏试验结果可以看出,该菌对大多数抗生素都有耐药性.特别是对一些兽医常用的抗生素,这其中的原因主要有:一,牛场兽医滥用抗生素或者长期使用几种抗生素,使细菌产生奶药性;二是细菌的耐药性质粒在细菌间进行传播.所以在对本病进行治疗时,应根据药敏试验结果进行治疗,交替用药,按疗程投药,这样既可获得较好的治疗效果,又能防止细菌产生耐药性.

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